使用诱变和序列捕获快速克隆植物中的抗病基因

Rapid cloning of disease-resistance genes in plants using mutagenesis and sequence capture

年份:2016

期刊:Nature Biotechnology

IF:41.667

机构:英国约翰伊恩斯中心(John Innes Centre)和澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)

1研究背景

(1)抗病基因(R-Genes)

植物在抵抗病原微生物的入侵的过程中，disease resistant genes(R基因)起到了十分关键的作用。而使用传统的育种方法，筛选出抗病的小麦品种需要长达5-15年的时间，因为很多有害等位基因和R基因存在连锁不平衡现象，通过染色体重组将两种性状进行分离比较困难。如下图所示，着丝粒区更容易发生染色体重组交换的现象，假如R基因和部分有害基因遗传距离过近或者本身存在连锁阻力，那么传统的育种方法很难培育出新的品系。小麦作为异源六倍体的大基因组植物，在育种上面临诸多的挑战!

小贴士:连锁不平衡(linkage disequilibrium)即两个基因相互连锁，发生染色体之间重组概率偏低，多少比例表示遗传距离是多少cM(厘摩尔)。

(2)R-Genes分离难点

R基因家族具有序列多样性等特点，所以鉴定R基因、分离R基因和克隆R基因成为无法解决的一大难题。构建遗传图谱并进行图位克隆的方法难以将这些R基因全部分离出来。加之连锁不平衡现象，使得传统的育种方法无法培育出真正的抗病小麦品种。

(3)Sr22和Sr45基因是迄今为止在小麦的五个主要的主导Sr基因中的两个。所有这五个基因(Sr33，Sr35和Sr50，Sr22和Sr45 )均表现出对茎锈病Ug99种族群体的抗性，而Sr22、Sr33和Sr50赋予多种病原体种群抗性。已经在小麦中遗传鉴定了约60种Sr基因，其中几种Sr在所有植物发育阶段也提供了广泛的抗性，例如Sr26、Sr32、Sr39、Sr40和Sr47。

2MutRenSeq

(1)原理

使用甲基磺酸乙酯(EMS)方法构建小麦突变体，使用液相捕获技术，对R基因进行快速克隆。

小贴士:EMS是一种特殊的诱变剂，属于烷化剂诱变最常用的一种。目前这种技术已经广泛用于植物突变体的构建，属于常见的育种方法，经济高效。相比于X光或宇宙辐射育种，EMS一般只会引起碱基的点突变，而不是出现大规模的染色体易位缺失等情况。2013年，日本科学家利用EMS技术，使用BSA分析策略得到了水稻耐盐基因，在不到3年时间内培育出高耐盐的水稻株系，该结果发表在Nature Biotechnology上。

(2)结果

对小麦使用EMS诱导后，使用特异性的RNA捕获探针对目标区域进行富集(即靶向区域液相捕获技术)，然后进行上机测序。通过比对野生型和抗性突变体的序列，获得茎锈病抗性基因Sr22和Sr45，转化为抗茎锈病小麦品系。

(3)优点

快速鉴定抗病基因(<24个月)、成本低廉。

3MutRenSeq抗性基因克隆的突变基因组学策略

(1)诱变

对野生型小麦进行EMS诱变处理，得到M2品系。接下来对M2品系中具有抗茎锈病株性状的株系做进一步筛选，得到易感品系和抗性品系。

(2)NLR靶向捕获文库构建和测序

a叶组织提取总基因组DNA并进行DNA定量和文库的制备。从小麦叶片组织中提取总DNA并进行靶向文库制备。针对NLR设计出特异性的RNA捕获探针，分别对易感品系和抗性品系的特定目标区域(NLR)进行捕获。目标区域富集完毕后，进行上机测序，测序平台为Illumina Hiseq和MiSeq。

bNLR读取和比较。使用BWA比对软件对下机数据进行序列比对，得到sam文件。使用samtools转换出这些比对上的短reads序列，使用de novo组装策略得到足够长的contigs，将这些contigs与靶向文库中最原始序列进行blast比对，换句话说，将野生型基因与捕获富集文库的序列比对，确定潜在SNP位置。

小贴士:BWA是一种序列比对软件，和bowtie一样能够用于将二代测序下机数据中短reads比对到参考基因组上。BWA的应用场景是DNA-Seq较多，bowtie则用于RNA-Seq较多。而samtools是一款十分强大的软件，可以将sam格式的文件转换出多种格式文件，如fasta序列信息等。

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